成骨不全

骨―肌肉系统的基因转移

某些骨科遗传性疾病，获得性疾病和其它骨―肌肉系统疾病都可通过基因疗法进行治疗，因此必须率先发展滑膜、软骨、韧带、肌腱、骨和肌肉的基因转移技术。有人在兔膝关节模型上，采用体内和体外基因转移技术将不同的基因转移到滑膜组织，体外方法已经可使被转移基因出现临时性表达，其表达强度不超过6周。有人将重组腺病毒直接注射到兔膝关节内并使其传染A型和B型滑膜细胞，其基因表达持续时间至少可达8周。在体内，大多采用单纯疱疹病毒和脂质体来转染滑膜细胞，但尚未获得高水平和长时间的基因表达效果。尽管在体内很容易将基因转移到滑膜细胞，但丰富的细胞外基质可阻碍基因转移到细胞内，这种情况对于骨和软骨细胞来说尤为重要，因为它们都有非常丰富的细胞基质，而且骨细胞基质是钙化的。

有人发现抽取和静脉会注后，人造血干细胞可进入血液循环和回归骨髓。人造血干细胞表面含有CD34分子，采用抗CD34亲和棒(affinity columus)从周围血中很容易被分离，并在静脉回归体内之前在体外采用逆转录病毒转导即可达到基因治疗之目的。

基因转移到肌肉不仅是治疗肌肉疾病的一条途径，而且是获得全身性基因产品和注射DNA编译免疫受体拮抗蛋白(immunizing the recipient against the proteins)的一条途径。当将质粒DNA注射到骨骼肌时，就被肌纤维吸取，并被延长基因表达时间。肌肉细胞显示出向免疫系统提呈抗原，这种抗原被发现是由于非常有效注入DNA合成的蛋白质，从而提供了强有力的抗原性。这些研究可望用于发展抗感染和抗肿瘤疫苗研究。另外，人们可采用直接基因转移方法将基因转移到成熟的肌纤维，也可采用体外方法将基因转移到肌母细胞。大量肌母细胞可在体外生长，它们很容易被逆转录病毒感染。这种方法的缺点是很难获得足够数量的肌母细胞以满足大量肌群注射的需求，此外是移植细胞的低植入率(1%)。

基因疗法在骨科疾病的应用

骨关节炎和类风湿关节炎注射的目的是将抗关节炎基因转移到病变的关节，采用局部基因转移到滑膜组织的方法是治疗累及少数关节和不累及关节外组织关节炎的一种方法，但不能治疗与关节炎有关的全身性疾病，如类风湿关节炎。有人报告，运用逆转录病毒和MFG-IRAP体外转移的人白介素-1(IL-1)受体拮抗基因导致了关节内人IL-1受体拮抗剂纤克定量(nanogram quanfifies)蓄积，而这已足够抑制注射IL-1β引起的炎症反应。尽管人IL-1受体拮抗基因表达随着时间的推移而渐渐减退，但这对于治疗抗原诱发性关节炎的价值已很高，拮抗的时间已足够长了。在抗原诱发性关节炎早期，当投入IL-1受体拮抗基因1天时，就具有软骨的保护作用和消炎作用，并可持续一周时间。

骨关节病变的治疗可能需要将基因转移到软骨细胞以补偿软骨基质结构蛋白的突变，或转移一些细胞因子基因，例如胰岛素样生长因子―1(IGF-I)和β―转化生长因子(TGF-β)，它们可抵制软骨的剥脱，增加软骨基质合成。目前软骨细胞已能在体外转导，回植后在体内的基因表达正在研究中。

Gaucher′s病Gaucher′s病的基因疗法寄希望于从cDNA文库中成功地克隆出人葡萄糖脑苷脂酶基因，然后将该基因转移到Gaucher′s病患者的成纤维细胞内，并采用逆转录病毒长末端重复核酸结构作为启动子维持葡萄糖脑苷脂酶基因的高表达水平。目前已在鼠造血干细胞获得成功，即将葡萄糖脑苷脂酶基因通过逆转录病毒体外转移细胞表面具有CD34抗原的造血干细胞。成骨不全和其他遗传性疾病成骨不全是基因缺陷性疾病，目前正常等量的缺陷胶原基因已被克隆，并已用于鼠模型研究。然而，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型成骨不全一般是由于Ⅰ型胶原显性负突变(dominant negative mutation)所致，要求基因疗法前使内源性缺陷基因保持沉默才能获得成功。Ⅰ型成骨不全却不存在这些限制，所以目前选择基因疗法更具优越性。最近，正在试图发展一种基因治疗新方法来治疗成骨不全，即将目的基因转移到原祖成骨细胞(osteoblast progenitor cells)。

其他类型的遗传性结缔组织病变，包括Ehlers-Danlos综合症，各种类型的粘多糖病和软骨营养不良也可采用基因疗法。软骨营养不良，Stickler综合症，软骨形成不良(achondrogenesis)，脊椎骨骺营养不良和低软骨生长病(hypochondrogenesis)也是由于Ⅱ型胶原基因缺陷所致，因此也可采用基因疗法进行治疗。血友病采用基因疗法是一个良好的选择，因为凝血因子的缺陷已弄清楚，且编码这些缺陷凝血因子的正常基因已被克隆。这些基因的表达似乎不再需要调节，因为这些凝血因子可在血清中具有很大的浓度范围。

肌营养不良(muschlar dystrophy)随着肌营养不良因子(dystrophin)的确定及其基因的克隆以及Duchenne-B ecker肌营养不良症缺陷分子的确立，给这些和其他遗传性肌肉病变的基因疗法奠定了基础。尽管Duchenne肌萎缩动物模型的建立和研究容易获得成功，但仍有许多难以克服的问题，例如营养不良因子是一个非常大的蛋白质，其cDNA长度达14Kb，远远超过了目前使用的基因载体碱基数。为此，人们研究出一类被称为微小原(minigenes)的物质有助于这些问题的解决。这些微小原含有DNA顺序的某些缺失结构，所以可产生更小的包含某些亲代分子生物特性的蛋白质。尽管DNA的缺陷是大片段的，但只要这种情况不常发生即可。在肌肉特异启动子和肌酸激酶的控制下，营养不良因子微小原已被用于产生转基因鼠(transgenic mice)，这种鼠携带一个矫正营养不良因子基因突变基因，从而导致转基因鼠子代肌异常症得以矫正。将这种技术应用到人体细胞基因疗法中目前还是受到几乎所有肌细胞都被营养不良因子转导这个事实的阻桡，而且该技术目前尚不成熟。

组织愈合肌肉―骨骼组织常常不能很好地愈合，某些生长因子目前已在临床使用以促进肌肉―骨骼组织的修复。例如TGF-β和碱性成纤维生长因子(bFGF)已有报告可促进软骨愈合，至于其他生长因子促进韧带愈合的作用目前正在研究。各种骨形成蛋白(BMP)不久前已在临床试用于骨不连的治疗；IGF-I可用于预防肌废用性萎缩，采用基因疗法转移有关蛋白质生长因子即可能解决这些问题，且基因表达只需要在组织愈合的时间内即可，从而使临时性基因表达技术用于临床。

其他疾病目前发现，软骨发育不全性侏儒，Crouzon综合症和Pteiffer综合症都是由于成纤维细胞生长因子受体缺乏所致，这种基因缺失导致的发育异常可通过基因疗法加以矫正，相应的技术正趋成熟。此外，一旦基因疗法用于癌肿的治疗，骨肉瘤、Ewing′s肉瘤和其他骨―肌肉系统的恶性肿瘤的治疗将获得改进。最后，类风湿病、系统性红斑狼疮和硬皮病也可得益于基因疗法。对于慢性系统性自身免疫性疾病来说，转换编码免疫抑制蛋白基因将具有良好的治疗价值，但这些基因必须有选择性地转移到免疫活性细胞或其他组织，在这些组织和细胞中，基因产物将变成全身性作用。

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